Identyfikacja nowych genów i regionów odpowiedzialnych za powstawanie wrodzonych wad kończyn u człowieka

Kierownik projektu: Prof. dr hab. med. Anna Latos-Bieleńska

Główny realizator projektu: Prof. dr hab. n. med. Jamsheer Aleksander

Konkurs: 495/N-NIEMCY/2009/0

Kwota dofinansowania: 780 000,00 zł

1. Aktualny stan wiedzy. Cele projektu. 

Wrodzone wady kończyn (WWK) są pod względem klinicznym i genetycznym heterogenną grupą zaburzeń rozwojowych. Mogą one mieć charakter izolowany lub też występować jako jeden z objawów w obrazie zespołów wad wrodzonych. Ze względu na ich wysoką częstość w populacji polskiej (ok. 37/10,000 żywo urodzonych noworodków, dane z Polskiego Rejestru Wrodzonych Wad Rozwojowych - PRWWR) mają one istotne znaczenie kliniczne. Ponadto poradnictwo genetyczne dla rodzin, w których urodziło się dziecko z WWK jest szczególnie ważne, ze względu na duży niepokój rodziców wywołany obecnością widocznej, nie dającej się ukryć wady. Osoby dorosłe z WWK obawiają się wystąpienia tych wad u swego potomstwa i kształtują swoje plany prokreacyjne na podstawie porady genetycznej. Podstawą właściwej porady genetycznej jest określenie etiologii obserwowanego zaburzenia, która w przypadku WWK, mimo znacznego postępu wiedzy, ciągle nie jest do końca zbadana.  

WWK mogą być spowodowane przez czynniki egzogenne (środowiskowe) oraz endogenne (genetyczne). W ostatnich latach zidentyfikowanych zostało wiele genów, w których mutacje zaburzają prawidłowy rozwój embrionalny zawiązków kończyn człowieka i prowadzą do wystąpienia WWK. Grupą wad o dobrze udokumentowanym podłożu molekularnym są wady dłoni i/lub stóp, takie jak: brachydaktylie, syndaktylie, polidaktylie, rozszczepy dłoni i/lub stóp oraz oligodaktylie (brak palców). W przypadku rodzinnego występowania ww. wad, ich uwarunkowanie genetyczne jest pewne. W przypadkach sporadycznych, obustronne występowanie wady również przemawia za wysokim prawdopodobieństwem jej genetycznego uwarunkowania.

Brachydaktylie (BD), syndaktylie (SD), polidaktylie (PD), rozszczepy dłoni i stóp (SHFM) i oligodaktylie, na podstawie obrazu kliniczno-radiologicznego i etiologii genetycznej podzielone zostały na szereg typów i podtypów. Dla niektórych typów/podtypów poszczególnych wad zidentyfikowano podłoże genetyczne. Jest nim najczęściej mutacja pojedynczego genu. W ostatnim latach coraz większą rolę patogenetyczną przypisuje się także submikroskopowym rearanżacjom chromosomowym. W części przypadków podłoże genetyczne WWK pozostaje nadal nieznane.  

Chociaż WWK traktowane całościowo występują z relatywnie dużą częstością, do badań genetycznych bardzo trudno zgromadzić jest pacjentów z poszczególnymi typami/podtypami wady. Unikatowe warunki stwarza PRWWR, działający od 1997 r. przy Katedrze i Zakładzie Genetyki Medycznej UM w Poznaniu, który monitoruje wszystkie urodzenia dzieci z wadami rozwojowymi w Polsce. Na podstawie kodu wady (wg ICD-10), jej opisu klinicznego, a także informacji czy dana wada jest obustronna oraz czy ma charakter rodzinny, możliwe będzie wytypowanie z bazy danych PRWWR grupy pacjentów z jedną z interesujących nas wrodzonych wad dłoni i/lub stóp (brachydaktylii, polisyndaktylii, syndaktylii, polidaktylii, rozszczepu dłoni i/lub stóp, oligodaktylii).   

Cele projektu:  

1) Identyfikacja nowych genów odpowiedzialnych za powstawanie wrodzonych wad kończyn, w szczególności wad dłoni i/lub stóp pod postacią brachydaktylii, syndaktylii, polidaktylii, rozszczepów dłoni i/lub stóp oraz oligodaktylii u człowieka.   

2) Poprawa diagnostyki molekularnej i poradnictwa genetycznego w grupie pacjentów z wrodzonymi wadami kończyn. Zainicjowanie badań molekularnych wśród wspomnianej grupy pacjentów, z perspektywą wprowadzenia ich do rutynowej diagnostyki genetycznej.  

2. Metody i środki badawcze: 

Przewiduje się nawiązanie kontaktu z rodzinami, których dziecko zostało zgłoszone do PRWWR z powodu wady kończyn i których dane osobowe, za ich pisemną zgodą, znajdują się w bazie danych Rejestru. Rodzinom tym zostaną zaproponowane badania molekularne. Na podstawie przygotowanych z PRWWR raportów wytypowano do badań 5 rodzin z izolowaną brachydaktylią, 52 rodziny z izolowaną polisyndaktylią oraz po ok. 400 rodzin z izolowaną syndaktylią i polidaktylią. W bazie PRWWR znajduje się także informacja o blisko 2000 przypadków sporadycznych izolowanych wad kończyn. W drugiej połowie roku 2008, do 120 rodzin (z ww. wadami), wysłana została pilotażowo korespondencja informująca o możliwości badań naukowych zmierzających do ustalenia genetycznego podłoża wady wrodzonej. Zainteresowanie badaniami genetycznymi wyraziło 15 rodzin, z których 7 dojechało do Ośrodka prowadzącego badania. W pozostałych przypadkach 10 przypadkach przewiduje się dojazd lekarza genetyka do rodzin (duże liczebnie, dobrze współpracujące rodziny, wysokie szanse znalezienia nieprawidłowości genetycznej) dla dokonania oceny klinicznej oraz pobrania krwi na badania w miejscu zamieszkania. W I połowie 2009 roku, planowane jest wysłanie analogicznej korespondencji do wszystkich zgromadzonych w bazie PRWWR rodzinnych przypadków wady dłoni i/lub stóp. Korespondencja z informacją o badaniach zostanie także wysłana do wybranych pacjentów ze sporadycznymi, obustronnymi WWK. Pierwsza faza projektu będzie polegać na dokładnej charakterystyce klinicznej i, w wybranych przypadkach, charakterystyce radiologicznej chorych członków rodziny. W drugiej fazie, wytypowane rodziny będą włączone do badań molekularnych, polegających na analizie (metodą PCR-sekwencjonowanie) sekwencji genu, którego mutacje mogą odpowiadać za określony obraz kliniczno-radiologiczny wady. W przypadkach rodzinnych, jeśli nie uda się wykryć mutacji w żadnym ze znanych dotąd genów, oraz jeśli wynik badania techniką porównawczej hybrydyzacji genomowej do mikromacierzy oligonukleotydowej (aCGH) będzie prawidłowy, w celu identyfikacji locus ko-segregującego z fenotypem choroby, przeprowadzona zostanie analiza sprzężeń z wykorzystaniem chipów SNP. W przypadkach sporadycznych, przy obustronnym występowaniu wady, również po uprzednim wykluczeniu mutacji w którymś ze znanych genów, wykonane zostanie badanie oligo aCGH. 

3. Spodziewane wyniki: 

Dokładna charakterystyka kliniczno-radiologiczna wrodzonej wady dłoni i/lub stóp pozwoli na zaklasyfikowanie jej do określonego typu i podtypu. Zbankowanie DNA (wyizolowanego z krwi pacjentów) lub ustalenie linii komórkowej umożliwi przeprowadzenie badań genetycznych zmierzających do zidentyfikowania molekularnego podłoża wady. Pozwoli to objąć poradnictwem genetycznym członków odpowiednich rodzin. Należy oczekiwać, że w toku prowadzonych badań uda się zidentyfikować nowe, nieopisane dotąd mutacje genów, których uszkodzenia powodują wystąpienie BD (IHH, BMPR1B, ROR2, NOG, CDMP1, HOXD13), SD (HOXD13, Cx43), PD (GLI3, ZRS), SHFM (TP63,WNT10B) i oligodaktylii (TBX3, TBX5). Identyfikacja nowych mutacji pozwoli na przeprowadzenie badań funkcjonalnych nad białkami kodowanymi przez nieprawidłowe geny. W przypadku wykluczenia mutacji w genach, których uszkodzenia odpowiadają za znany fenotyp wady, bądź też w przypadku wad o nieznanym dotąd uwarunkowaniu, istnieje wysokie prawdopodobieństwo, że uda się zidentyfikować patogenne mutacje „nowych” genów. Wykrycie mutacji leżących u podstaw badanych przez nas wad wrodzonych umożliwi podjęcie próby ustalenia korelacji genotypowo-fenotypowej, a także na określenie stopnia zmienności ekspresji oraz zmienności penetracji wady w obrębie dotkniętych rodzin. Korelacja genotypowo-fenotypowa pozwoli na identyfikację regionów/pozycji aminokwasowych białka, która są istotne dla jego prawidłowego funkcjonowania, a także umożliwi powiązanie konkretnych uszkodzeń z ciężkością fenotypu wady.   

5-10% przypadków sporadycznych obustronnych wad kończyn spowodowana jest submikroskopowymi rearanżacjami genomowymi, możliwymi do wykrycia w badaniu oligo aCGH. Istnieją zatem szanse, że uda się zidentyfikować regiony DNA, w obrębie których położone są geny (lub też sekwencje regulatorowe genów) odpowiadające za embrionalny rozwój kończyn, a także, że uda się wytypować „geny kandydujące”, których delecja/duplikacja prowadzi do powstania wady. 

Oczekujemy, że identyfikacja molekularnego defektu genów sterujących embrionalnym rozwojem dłoni i/lub stóp pozwoli na lepsze zrozumienie mechanizmów odpowiedzialnych za prawidłową organogenezę kończyn człowieka. Wyniki naszych badań powinny pozwolić na wdrożenie do rutynowej diagnostyki genetycznej analizy przynajmniej niektórych z badanych przez nas genów. Dzięki temu będzie możliwe objęcie wiarygodnym poradnictwem genetycznym wielu rodzin dotkniętych wadą kończyn. Przewiduje się również w przyszłości stworzenie zespołu, zajmującego się poradnictwem genetycznym i diagnostyką molekularną we wrodzonych kończyn i chorobach genetycznych układu kostnego. Należy podkreślić, że połączenie możliwości obydwu jednostek współpracujących (polskiej i niemieckiej) stwarza unikatowe warunki do tego typu badań i rokuje uzyskanie w krótkim czasie olbrzymiego postępu w poznaniu podłoża molekularnego WWK, co będzie miało nie tylko wymiar naukowy, ale również wielkie znaczenie praktyczne (poprawa poradnictwa genetycznego na świecie dla tej grupy pacjentów).